Как сделать «БиоПринтер»

Сегодня рассказ пойдет о биопечати — процессе аналогичному 3D печати, но в качестве смол здесь используются бактерии и т.п. вещества, то есть биологические материалы.

Работам в области печати человеческих тканей и органов уделяют большое внимание как исследовательские лаборатории, так и крупные компании, с целью последующего применения этих органов и тканей для тестирования медикаментов и трансплантации человеку. Более подробно можно узнать об этом по этим ссылкам:

Выращивание новых органов и печать человеческой почки.

Хоть и кажется все это невероятно сложным, но на деле базовые технологии довольно доступны, ведь они основаны на струйной 2D печати и/или 3D печати! Наша команда тоже решила «пообщаться» с этими технологиями, и в итоге появился совместный проект — «Биопринтер».

Это руководство лишь часть общего документа, написанного нами для нашего сообщества, так что статья довольно большая. Тем же, кто любит по-быстрее, можно посмотреть небольшое видео:

Шаг 1: Разбор старого струйного принтера.

Начали мы с манипуляций со старым струйным принтером, который мы буквально спасли от свалки. С широкодоступными низко бюджетными струйными принтерами можно сделать много чего интересного, но есть у них и некоторые недостатки для нашей работы, о которых речь пойдет в следующем шаге (или можно сразу перейти к Шагу 3:, где мы собрали собственный биопринтер с нуля).

«Раздевание» принтера

Мы вскрыли брошенный HP 5150, чтобы затем использовать его в качестве основы биопринтера. Нужно лишь снять пластиковые детали корпуса, но чтобы при этом сохранилась функциональность кнопок на передней панели.

На принтере есть небольшой переключатель, который срабатывает на открытие крышки корпуса. Его при снятом корпусе нужно будет зафиксировать, иначе печать будет невозможна. Сделать это можно нажав на него и заклинив зубочисткой или наклеив кусочек пластика, или вкрутив винт, а проще вынуть и перепаять на кнопку вкл/выкл или перемкнуть контакты проводком (то есть создав режим постоянно закрытой крышки).

Еще один переключатель находится внутри механизма подачи бумаги и фиксирует наличие этой самой бумаги. Вам, возможно, потребуется его перепаять если планируете использовать сам механизм подачи.

После того, как принтер «раздет» и кнопки-датчик настроены на режим работы необходимо что-нибудь напечатать! Это будет проверкой того, что все правильно снято и работают ли кнопки управления принтером. К тому же, это довольно увлекательно наблюдать наглядно за работой механизмов струйного принтера. При этом берегите свои пальцы — картриджи двигаются очень быстро!

Разбор картриджей

Следующая задача это попытаться открыть картриджи, чтобы наполнить их чем-нибудь более интересным. Мы будем вскрывать абсолютно новые картриджи, потому что старые, как правило, имеют засорившиеся остатками чернил сопла. На этих старых картриджах можно попрактиковаться их вскрывать. Еще не помешает сделать пробную печать и промыть печатную головку, если конечно программное обеспечение принтера это позволяет.

Отклеив все этикетки, вы увидите, что большинство картриджей имеют приклеенную крышку, как правило, с небольшими вентиляционными отверстиями, позволяющие входить воздуху и вытекать чернилам. Чтобы быстро снять крышку нужно пройтись по клееному шву канцелярским или столярным ножом. Но при этом БУДЬТЕ ОСТОРОЖНЫ — лезвия этих ножей очень остры! Используйте перчатки с защитой от разрезания и/или зажмите картридж в тисках во время снятия крышки.

Как вариант, вы можете использовать подходящий электроинструмент для отделения крышки. Это «намного проще», но не совсем чисто. Имейте в виду, что картридж возможно придется снова собрать и вставить обратно в держатель. Если кто знает другой, более простой способ вскрытия струйного картриджа, то не стесняйтесь, делитесь в комментариях! Например, может есть какой-нибудь растворитель для клея крышки или самого картриджа?

Вскрыв картридж, вы увидите, что в его чернильном резервуаре находится небольшая губка, удерживающая чернила. Цветные картриджи имеют чернильные отсеки с отдельными губками (обычно это голубой-пурпурный-желтый, а не красный-зеленый-синий, так как цветная печать на белой бумаге это субстрактивный, то есть основанный на вычитании элементов, процесс). Чернила можно выжать и сохранить для других экспериментов (например для бумажной хроматографии). А затем промывка, промывка и еще раз промывка дистиллированной или деионизированной водой — ведь нам не нужно, чтобы головка засорилась минеральным осадком. Нам нужно вымыть оттуда все чернила, чтобы они не влияли на ход эксперимента.

После того, как чернильный резервуар абсолютно чист, необходимо наполовину заполнить его дистиллированной или деионизированной водой, закрыть крышку, вставить в картриджедержатель и сделать пробную печать. Большие шансы на то, что как бы вы не старались, но некоторое количество чернил все равно осталось. В данном случае, просто распечатывайте его, пока он не станет печатать чисто, а потом распечатайте его еще немного.

Мы обнаружили, что из полностью заполненного картридж вода просачивается через печатную головку, но если налить воды немного, то протечки нет. Это, в принципе, удобный способ промыть печатную головку без необходимости распечатывать ее.

Заполнение картриджей

А вот теперь то, чем вы заполните картриджи, зависит от вашего воображения! Наша команда для начала заполнила бывший черный картридж зеленым пищевым красителем и распечатала пробную страницу, чтобы убедиться, что это работает. Вы можете заполнить картридж, к примеру, флуоресцентным красителем и напечатать плакаты «светящиеся» в ультрафиолете. Или же заполнить картридж «невидимыми» чернилами и печатать тайные сообщения друзьям.

Первую реальную биопечать мы хотели провести с помощью чего-то простого, а не переходить сразу к печати живым материалом. И в качестве чего-то простого выступил раствор арабинозы, который мы распечатали на фильтровальной бумаге. Затем распечатанный участок фильтровальной бумаги вырезали и положили его на пластину агарозы, на которой вырастили колонию кишечной палочки в которую мы внедрили плазмиды pGLO. Эти плазмиды содержат зеленофлуоресцирующий белок (gfp c) под контролем арабинозо-сенситивного промотора.

В итоге, в местах, где была пропечатана арабиноза на фильтровальной бумаге, сейчас под воздействием ультрафиолета кишечная палочка излучает зеленое свечение! И обратите внимание, что вся прелесть эксперимента в его простоте: мы всего лишь печатали раствором простых сахаров, а не объемными живыми клетками, к тому же, печатали на бумаге, то есть нет необходимости менять механизм подачи бумаги. Вы еще можете попробовать печатать антибиотиками, или даже белками, такими как ферменты или факторы роста.

Предпоследнее из представленных выше фото показывает нашу первую пробную печать, когда мы распечатали арабинозу на одной половине фильтровальной бумаги — под воздействием ультрафиолета эта половина чашки светится зеленым. На втором фото показан распечатанный логотип «eyeball» нашей команды. Это успех! (к сожалению резкость печатного рисунка оставляет желать лучшего; полагаем, что арабиноза склонна диффундировать через фильтровальную бумагу, тем самым размывая распечатанный рисунок и если печатать непосредственно на агарозе, то должно получиться намного лучше).

Шаг 2: «Недостатки» — слишком высокое разрешение принтера.

Это ранее упомянутый недостаток для нашей работы — современные принтеры имеют слишком высокое разрешение!

Много времени мы уделили на изучение печатных головок струйных принтеров под микроскопом. Серебряная полоска которую можно увидеть на нижней части картриджа называется сопельной пластиной. По сути это просто кусочек нержавеющей стали с проходящими сквозь него ровными соплами. В картридже с черными чернилами эти сопла расположены в четыре ряда, два из которых вы можете увидеть на первом фото. Сопла фактически пронумерованы от 1 до 416, и в головке размером около 6 мм 416 сопел дают примерно 1200 точек на дюйм.

То есть, 1/1200 дюйма дает интервал в 21 мкм. К тому же, сами сопла фактически диаметром около 23 мкм. Это область размеров эукариотической клетки - упс! С такой головкой мы можем печатать клетками гораздо меньшими кишечной палочки (приблизительно 1 мкм в диаметре) и возможно даже дрожжевыми клетками (приблизительно 10 мкм в диаметре).

Но и это еще не все!

Если снять сопельную пластину, то фактически открывается доступ к печатной головке, чуду кремневых технологий, в которой находятся устройство управления жидкостью, микроскопические обогреватели, испаряющие порции чернил (в тепловом струйном принтере) и куча встроенной электроники. Прямо рай для микроскописта-любителя!

Последнее из вышепредставленных фото немного тревожит нас. По всей видимости это фильтр, интегрированный в кремний, и располагающийся между контейнером для чернил и самой печатной головкой! По изображению с микроскопа мы полагаем, что отверстия в фильтре около 3 мкм, это может быть слишком мало даже для клеток кишечной палочки. Упс!

И еще, если использовать покупной струйный принтер, то придется вынуть механизм подачи бумаги, чтобы было можно печатать на чем-нибудь другом (например, на листах агара). К тому же, если пользоваться существующими драйверами для принтеров, то они дают слишком малый контроль над поведением печатной головки. Можно попытаться адаптировать линуксовские драйвера под ваши требования, но это выльется в отдельный проект.

Итак, пожалуй лучшим вариантом будет начать сборку с чистого листа — и просто собрать собственную печатную платформу, над которой будет полный контроль!

Шаг 3: InkShield — печатная головка биопринтера.

Решение найдено!

Похоже что использовать современный струйный принтер с высоким разрешением 1200 точек/дюйм для печати чем-либо большим, чем дрожжевые клетки, у нас не получится. Да и вполне вероятно, что и дрожжами или даже клетками кишечной палочки с помощью струйного картриджа печатать на таком принтере не получится!

Другие группы, использующие струйные принтеры, обычно выбирают устаревшие принтеры «НР» с разрешением 300 точек/дюйм и диаметром сопла предположительно около 80 мкм или около того, что достаточно для печати клетками человека. Например, вот эта группа пользуется принтером «НР Deskjet 500», эта модель возвращает нас в далекий 1990 год — но они находят его самым удачным из всех!

Еще используют комплект доработки струйных принтеров от Parallax, позволяющий управлять картриджем 96 точек/дюйм HP 51604A, но и картридж и комплект несколько лет больше уже не производят.

На наше счастье Николас Льюис признал необходимость струйной платформы для самодельщиков, и начал краудфандинговую кампанию для создания Inkshield — струйной платформы с открытым кодом и совместимой с Arduino. Данная платформа строится на основе струйного картриджа серии HP C6602, это специализированный картридж с 12 соплами и разрешением 96 точек/дюйм предназначен для печати этикеток для таких вещей как кабели (или струйные картриджи!).

96 точек/дюйм эквивалентно интервалу между точками 265 мкн. На представленных выше изображениях можно заметить, что фактический размер сопел составляет примерно 1/3 от расстояния между ними, а в цифрах около 85 мкн — что просто идеально для наших задач!

Платформа InkShield разработана под управление с Arduino, но ей требуется более высокое напряжение, чем 5В от Arduino, когда он запитан от USB. Поэтому необходимо будет подать 9-12В через дополнительный разъем питания на InkShield или через питающий разъем на Arduino.

Шаг 4: Второй вариант биопринтера — Hackteriabot!

Платформа

Платформу нашего второго биопринтера мы сделали из дек добытых из пары старых СD-приводов, вдохновленные при этом платформой самодельного лазерного резака/аппарата микрофлюидики созданного нашими друзьями из Hackteria:

http://hackteria.org/wiki/index.php/HackteriaLab_2011_Commons#Micro_Manipulator

http://hackteria.org/wiki/index.php/DIY_Micro_Dispensing_and_Bio_Printing

Необходимо взять две деки, которые передвигают лазерные головки CD/DVD-приводов и расположить их под углом 90 градусов (относительно направления движения головки) и вуаля — двухосевая платформа с малыми габаритами и высокой точностью позиционирования — готова!

Способ использования механизма позиционирования лазерной головки (деки) от CD-привода для создания высокоточной двухосевой платформы конечно не нов, и вот несколько ссылок описания этого способа:

Reprap, CNC from PC, mini CNC, Blu-ray CNC, Laser CNC, Blu-ray Laser CNC

Шаг 5: Создание двухосевой платформы из дек CD/DVD-приводов.

«Добыча» деталей из CD/DVD-приводов.

Давайте дадим старым дисковым приводам, которые уже никому не нужны, вторую жизнь. Я нашел кучу таких на городском пункте утилизации, и вам советую проверить подобные в своем районе.

Разобрать привод достаточно легко, для этого можно использовать уловку со скрепкой для открытия лотка.

Вероятно, может потребоваться разобрать несколько приводов для того, чтобы найти деку с шаговым двигателем. В нашем случае примерно половина из разобранных приводов имели моторчики постоянного тока, которые перемещают каретку с лазерной головкой. Если кто-то знает, как определить визуально привод с шаговым двигателем дайте знать в комментариях! Вот при вскрытом приводе это определяется легко: от шагового двигателя отходят четыре провода, как правило в виде небольшого шлейфа, а от моторчика DC всего два (см. фото).

Отличие моторчика DC от шагового двигателя в том, что последний может провернуться на конкретное число шагов, где каждый шаг это часть полного оборота. Это позволяет легко получить высокую точность позиционирования, без необходимости сооружать систему обратной связи для проверки местоположения. К примеру, в 3D-принтерах для позиционирования печатной головки обычно используются шаговые двигатели.

Шаговый двигатель

Проверив несколько серийных номеров в интернете, мы наткнулись на один шаговый двигатель с маркировкой PL15S-020, который оказался распространенным и очень прилично описанным биполярным шаговым двигателем. Многие другие шаговые двигатели которые мы нашли очень похожи на него, поэтому предполагаем, что и параметры у них одинаковые (перенос аннотации по гомологии).

Даташит: http://robocup.idi.ntnu.no/wiki/images/c/c6/PL15S020.pdf

Этот особенный шаговый двигатель делает 20 шагов за оборот (не супер, но вполне достаточно), и его ходовой винт имеет шаг 3 мм/оборот. То есть, каждый шаг двигателя равен перемещению лазерной головки на 150 мкн — что не плохо! Можно также значительно повысить разрешение с помощью микростеппинга. К примеру, простой восьмикратный микростеппинг теоретически может дать разрешение менее 20 мкн, но это уже излишне, если учитывать механические недостатки системы и разрешение нашей печатной головки.

Поскольку все мы кое как изучили 101-е шаговые двигатели, то решили не усложнять и оставить полный шаг. На сайте Arduino есть несколько схем для биполярных шаговых двигателей, а также примеры кода для их запуска. Для реализации схемы, показанной на последнем рисунке, мы приобрели несколько Н-мостов SN754410NE.

Даешь повторное использование!

Старые дисковые приводы содержат много классных деталей! Например, механизм выдвигания лотка, в котором есть моторчик DC и несколько низкоскоростных передач, и которые можно использовать для разных веселых вещей. Или мотор-шпиндель вращающий CD-диски, это, как правило, высокопроизводительный бесщеточный DC моторчик который можно использовать для легковесных радиоуправляемых самолетов или вертолетов. И к тому же куча переключателей, потенциометров, та же лазерная головка, иногда даже соленоиды! А ненужные компоненты желательно отвезти на пункт переработки электроники.

Шаг 6: Сборка.

Материалы:

— две деки дискового привода с шаговыми двигателями (желательно подобных) из старых CD/DVD-приводов
— комплект InkShield с чернильным картриждем и картиджедержателем
— по желанию: дополнительный струйный картридж НР С6602
— Arduino Uno
— два H-моста SN754410NE для драйверов двигателей
— шилд для Arduino и/или маленькая макетная плата
— провода, болты, распорки, материал площадок

На вышепредставленных фото показаны два разных биопринтера собранных нами. Второй из них имеет сверху изящную акриловую пластину, и большее пространство для размещения компонентов.

Нижняя дека CD-привода перемещает синюю пластину на которой располагается то, на чем вы печатаете (например, пластина агарозы). Механизм верхней деки расположен под углом 90 градусов к нижнему и перемещает струйную печатную головку. Для крепления синей платформы к головке нижней деки и крепления картриджедержателя к головке верхней деки мы использовали болты и пластик для прототипирования. Электрокомпоненты совмещенные с Arduino Uno располагаются снизу, далее белая плата InkShield (подключена к картриджедержателю красивым белым шлейфом), а уже сверху плата с драйверами двигателей.

Бумажные полоски с нанесенной сеткой наклеенные на верхнюю и нижнюю деки позволяют отслеживать положение по осям X и Y. Общая печатная площадь составляет примерно 3.8х3.8 см с разрешением 150 мкн/шаг. При этом обратите внимание, что разрешение шаговых двигателей сходно с разрешением печатной головки — 96 точек/дюйм или 265 мкн/шаг, но точки напечатанные головкой четко отделены — больше похоже на 150-200 мкн.

Шаг 7: Это успех!

Это наш первый, честное слово, «биопринт»… Чернильный картридж мы заполнили жидкой культурой кишечной палочки с плазмидами pGLO, немного изменили строку «I <3 InkShield» в демо программе для Arduino, идущей в комплекте с InkShield, и напечатали пару строчек «I <3 BioCurious» в чашке Петри (код приложу как только разберусь, как это делается). Чашка с агаром была заполнена почти до верха для уменьшения расстояния до печатной головки.

Как вы можете видеть печать живыми клетками кишечной палочки прошла успешно! Мы, скорее всего, слишком долго оставили колонии для роста, и поэтому буквы слегка размыты. А еще, вероятно из-за небольшого разбрызгивания струйной головки, образовались пятна маленьких колоний блуждающих клеток. Думаю мы исправим это путем регулировки вязкости или плотности клеток культуры загружаемой в картридж.

Но все же, для первого раза не плохо!

После распечатки мы продезинфицировали поверхности хлоркой, ополоснули чернильный резервуар тоже с хлоркой, позволив нескольким каплям очищающего раствора просочится сквозь печатную головку, а потом промыли большим количеством деионизированной воды, чтобы удалить всю хлорку из печатной головки.

Наверное, не плохо было бы прикупить подержанный ультразвуковой очиститель ювелирных изделий, которым можно удалять налет из мертвых клеток или другие отложения, образующиеся в печатной головке.

Шаг 8: Извлеченные уроки и планы на будущее.

Мы занялись этим проектом с практически нулевыми навыками биопечати, работы с шаговыми двигателями, управления струйными картриджами и даже программирования Arduino! И поэтому, вполне закономерно, сделали биопринтер не совсем идеально, как это могло бы быть. И вот несколько вещей, которые мы могли бы сделать иначе в следующий раз:

— Конечно полезно понять как работают шаговые двигатели и научиться ими управлять, но мы могли бы сэкономить время и усилия адаптировав некоторые RAMPS технологии (RepRap Arduino MEGA Pololu Shield), которые уже были разработаны для этих целей сообществом 3D-печати. К примеру, шаговые драйверы pololu уже имеют встроенный микростеппинг.

— Создание собственной двухосевой платформу почти бесплатно это конечно здорово! Но при этом мы используем шаговые двигатели не по их первоначальному назначению, и это начинает сказываться. Так у нас уже было несколько проблем с изредка случающимися биениями нижнего яруса, предположительно из-за очень частого перемещения яруса вручную, что вызвало большой износ пластиковых деталей червячной передачи. Лучше было бы купить новые шаговые двигатели, вырезанные лазерной резкой и кронштейны к ним, добавить несколько микропереключателей в качестве концевиков и прописать функцию сброса позиции в софте.

— Как только начинаешь искать новые шаговые двигатели, кронштейны к ним, электрокомпоненты RAMPS, то возникает вопрос — а почему бы не создать сразу 3D-принтер? Если мы пресытимся нашей уже созданной версией биопринтера, то скорее всего так и сделаем. Но стоить это уже будет на порядок выше или также…

— Наличие всего одной печатной головки имеет свои ограничения. Если мы действительно хотим сделать что-то из разряда технологий создания живых тканей, то необходимо иметь возможность печатать сразу несколькими типами клеток и прокладывать какой-нибудь строительный материал между ними. В потенциале, мы могли бы использовать два струйных картриджа расположив их рядом друг с другом. «Большие мальчики» используют для этих целей шприцевые дозаторы и выглядит это так: несколько шприцевых насосов расположены рядом с принтером и каждый из них питает печатную головку своим печатным материалом через тонкую трубочку и иголку, расположенную на этой головке. Будьте в теме…

— А теперь простые истины… Зачем мы вообще занимаемся этим самодельным биопринтером? Я не думаю, что такая команда как наша может на равную конкурировать с крупными компаниями в области печати человеческих тканей и органов. Одно лишь поддержания живых клеток в нужном состоянии требует немалых усилий. С растительными клетками намного проще работать!

Между тем, вот еще парочка мыслей:

— Печать градиентов питательных веществ и/или антибиотиков на слое клеток для изучения комбинаторных взаимодействий — или даже выбрать различные изоляты из образцов окружающей среды.

— Печать шаблонов факторов роста на слое эукариотических клеток для изучения клеточной дифференцировки.

— Печать двух или нескольких микробных видов на разном расстоянии друг от друга, для исследования обменных взаимодействий.

— Постановка расчетных задач в виде выстроенного из микробов 2D шаблона на чашке Петри.

— Изучение систем реакция-диффузия.

— Печать 3D-структур путем наложения слоев используя струйную печатную головку. А еще как вариант сделать все вышеперечисленное в 3D!

— Печать клетками в растворе альгината натрия, на поверхности, смоченной хлористым кальцием, чтобы создать гелевую 3D структуру (аналогично процессу сферификации в молекулярной гастрономии).

— Еще идеи? Выкладывайте их в комментариях!

Шаг 9: Дополнение: так вы хотите заниматься настоящей наукой?

«БиоПринтер», описанный здесь, это всего лишь прототип. Но поскольку мы получили очень серьезные вопросы по его использованию в научных лаборатория, то вот несколько рекомендаций:

— Команда Delphine Dean’s из университета Clemson занимается биопечатью на модифицированном принтере HP Deskjet 500, и вы можете посмотреть их видео по созданию поры клеточной мембраны используя обычный струйный принтер! А еще там тонны полезной информации о том, как обращаться со струйным принтером являющимся лабораторным оборудованием, как чистить картриджи, как сделать пригодные клеточные суспензий, и несколько увлекательных не 3D печатных проектов.

— Мы еще не доказали себе в полной мере, что картридж HP C6602 может печатать эукариотическими клетками. Скорее всего просто засорилась печатная головка, потому что мы не прочищали ее от клеточного мусора ультразвуком после предыдущей печати. Будем держать вас в курсе…

— Печать может занимать несколько минут, поэтому держите принтер под колпаком во избежание загрязнения.

— Электронику поместите в пластиковую упаковку или сделайте защитный корпус, чтобы она оставалась чистой и сухой. Все остальное после работы можно протирать с хлоркой.

— Наверняка даже можно использовать автоклаву для обработки дек и печатной головки — остается только это выяснить! Пластиковые детали картриджа должны выжить в автоклаве, но может и погнуться. А вот на счет клея, используемого для крепления кремниевой печатной головки к пластиковому картриджу, без понятия.

По публикациям МозгоЧина

© "Энциклопедия Технологий и Методик" Патлах В.В. 1993-2010 гг.